Noopept Logo

Efeito Neuroprotetor do Noopept em Modelo Celular Relacionado ao Alzheimer

Ostrovskaya RU, Gudasheva TA, Voronina TA, Seredenin SB. Neuroprotective effect of novel cognitive enhancer noopept on AD-related cellular model involves the attenuation of apoptosis and tau hyperphosphorylation. Journal of Biomedical Science. 2014;21:74. DOI: 10.1186/s12929-014-0074-2.


Resumo

Contexto

Noopept (N-fenil-acetil-L-prolilglicina éster etílico) foi projetado como um análogo dipeptídico do piracetam, um conhecido potenciador cognitivo. Experimentos anteriores demonstraram o efeito restaurador cognitivo do noopept em vários modelos animais da Doença de Alzheimer (DA). O noopept também mostrou prevenir desequilíbrios iônicos, excitotoxicidade, acúmulo de radicais livres e citocinas pró-inflamatórias, além de déficits de neurotrofinas característicos de diferentes tipos de danos cerebrais, incluindo a DA. Este estudo investigou a ação neuroprotetora do noopept em um modelo celular de toxicidade induzida por Aβ25–35 em células PC12, revelando os mecanismos subjacentes.

Resultados

O noopept (10 μM, adicionado 72 horas antes da exposição a Aβ25–35) protegeu as células PC12 contra lesões induzidas por Aβ25–35 (5 μM por 24 h). O tratamento com noopept aumentou a viabilidade celular, reduziu o número de células apoptóticas, os níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) e cálcio intracelular, e restaurou o potencial da membrana mitocondrial. Além disso, o noopept atenuou significativamente a hiperfosforilação da tau em Ser396 e melhorou as alterações na morfologia celular induzidas por Aβ25–35.

Conclusões

Os dados sugerem que o noopept protege contra os efeitos deletérios de Aβ, inibindo danos oxidativos, sobrecarga de cálcio e a via apoptótica mitocondrial. Suas propriedades neuroprotetoras incluem a redução da fosforilação da tau e a restauração da morfologia alterada das células PC12, afetando tanto os mecanismos patogênicos comuns quanto os específicos relacionados à DA.



Introdução

A Doença de Alzheimer (DA) é a forma mais comum de doença neurodegenerativa, acompanhada por demência relacionada à idade, afetando 27 milhões de indivíduos em todo o mundo. Os mecanismos subjacentes à progressão da DA incluem o acúmulo excessivo de amiloide, fosforilação aberrante da proteína tau, estresse oxidativo, inflamação crônica, excitotoxicidade, desregulação de neurotrofinas, instabilidade do citoesqueleto, perda sináptica e neuronal.

Os tratamentos farmacológicos atuais, como inibidores de colinesterase e antagonistas do receptor NMDA, proporcionam benefícios sintomáticos, mas não impedem a progressão da doença. Nos últimos anos, estratégias terapêuticas têm buscado drogas capazes de modificar a doença, focando em reduzir a produção de Aβ, prevenir sua agregação em placas amiloides e estimular sua remoção. No entanto, os resultados dessas abordagens têm sido limitados.

A complexidade multifatorial da DA exige abordagens terapêuticas multitarget para obter respostas sinérgicas. Neuropeptídeos, como o noopept, têm se destacado devido à sua alta atividade biológica e capacidade de interagir com múltiplos alvos, apresentando efeitos cognitivos e neuroprotetores promissores, como mostrado em estudos in vivo e in vitro.

Métodos

Culturas celulares e tratamentos

Células PC12 foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 5% de soro de cavalo, 2 mM de L-glutamina e 50 μg/mL de gentamicina. A diferenciação foi induzida com NGF (50 ng/mL) por 5 dias. Após pré-tratamento com noopept (10 μM) por 72 horas, as células foram expostas a Aβ25–35 (5 μM) por 24 horas.

Medição de viabilidade celular e apoptose

A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTT. Após os tratamentos, as células foram incubadas com solução de MTT (0,5 mg/mL) por 4 horas e solubilizadas com DMSO. A absorbância foi medida em 540 nm. Apoptose foi quantificada por citometria de fluxo utilizando o kit Annexin V/PI.

Medição de cálcio intracelular

Após o tratamento, as células foram lavadas e incubadas com o indicador de cálcio Fluo-4 AM (4 μM) por 20 minutos. A fluorescência foi medida em um espectrofotômetro.

Medição de espécies reativas de oxigênio (ROS)

A geração de ROS foi medida utilizando o H2DCFDA (5 μM). Após o tratamento, as células foram incubadas com o corante e lavadas antes de medir a fluorescência.

Avaliação da função mitocondrial

O potencial de membrana mitocondrial foi medido usando o corante JC-1. Após os tratamentos, as células foram incubadas com JC-1 por 20 minutos e a fluorescência foi avaliada.

Western Blot

A fosforilação da tau foi analisada por Western Blot utilizando anticorpos específicos para tau fosforilada em Ser396. A densidade das bandas foi normalizada em relação à β-tubulina.

Resultados

Efeito do noopept na viabilidade celular e apoptose

A exposição ao Aβ25–35 reduziu a viabilidade celular em 32%, enquanto o pré-tratamento com noopept aumentou a viabilidade em 230% em comparação ao controle. O noopept também reduziu significativamente os níveis de apoptose inicial e tardia induzidos por Aβ25–35.

Efeito do noopept em cálcio intracelular, ROS e potencial mitocondrial

O Aβ25–35 aumentou os níveis intracelulares de cálcio e ROS e reduziu o potencial de membrana mitocondrial. O noopept inibiu esses efeitos, protegendo as células contra o estresse oxidativo, desregulação de cálcio e disfunção mitocondrial.

Redução da fosforilação da tau induzida por Aβ

Aβ25–35 induziu a hiperfosforilação da tau em Ser396. O noopept reduziu significativamente esse efeito, sugerindo que a proteção do noopept está relacionada à estabilização do citoesqueleto.

Amelioração da morfologia celular

Células expostas a Aβ25–35 apresentaram menor número e comprimento de neuritos. O noopept restaurou esses parâmetros, aumentando o comprimento dos neuritos de 129 μm para 203 μm e melhorando a morfologia celular.

Discussão

Os resultados deste estudo demonstram que o noopept protege células PC12 contra os efeitos tóxicos de Aβ25–35, envolvendo a atenuação de estresse oxidativo, sobrecarga de cálcio e disfunção mitocondrial. Além disso, o noopept diminui a fosforilação anormal da tau e restaura a morfologia celular. Esses achados destacam o potencial terapêutico do noopept em doenças neurodegenerativas, como a Doença de Alzheimer.

Conclusão

O noopept apresenta propriedades neuroprotetoras que incluem a supressão moderada do estresse oxidativo, influxo de cálcio, estabilização da função mitocondrial e redução da apoptose. Sua capacidade de reduzir a fosforilação da tau contribui para a estabilização e crescimento dos neuritos, oferecendo uma abordagem promissora para a proteção contra a toxicidade induzida por Aβ.

Abreviações

Conflitos de Interesse

Os autores declaram que não possuem conflitos de interesse.

Contribuições dos Autores

Agradecimentos

Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo Grant para apoio estatal às principais escolas científicas da Federação Russa (nº 5923.2014.4 para VAV).
Os autores agradecem ao Prof. Grivennikov I.A. (Instituto de Genética Molecular, Academia Russa de Ciências, Moscou) pelo fornecimento da linha celular de feocromocitoma de rato.

Detalhes dos Autores

  1. Instituto de Farmacologia V.V. Zakusov RAS, Baltiyskaya 8, 125315 Moscou, Rússia.
  2. Instituto de Bioquímica e Genética, Centro Científico Ufa RAS, Prospect Oktyabrya, 71, 450054 Ufa, Rússia.

Referências

  1. Thies W, Bleiler L. Alzheimer’s Association, 2011 Alzheimer’s disease facts and figures. Alzheimers Dement 2011; 7:208–244.
  2. Krstic D, Knuesel I. Deciphering the mechanism underlying late-onset Alzheimer disease. Nat Rev Neurol 2013; 9(1):25–34.
  3. Schneider LS, Dagerman KS, Higgins JP, McShane R: Lack of evidence for the efficacy of memantine in mild Alzheimer Disease. Arch Neurol 2011, 68:991–998.
  4. Mangialasche F, Solomon A, Winblad B, Mecocci P, Kivipelto M: Alzheimer’s disease: clinical trials and drug development. Lancet Neurol 2010, 9(7):702–716.
  5. Longo FM, Massa SM: Neuroprotective strategies in Alzheimer’s Disease. NeuroRx 2004, 1:117–127.
  6. Buccafusco JJ: Emerging cognitive enhancing drugs. Expert Opin Emerg Drugs 2009, 14:577–589.
  7. Frautschy SA, Cole GM: Why pleiotropic interventions are needed for Alzheimer’s Disease. Mol Neurobiol 2010, 41:392–409.
  8. Kaidanovich O, Eldar-Finkelman H: Peptides targeting protein kinases: strategies implications. Physiology 2006, 21:411–418.
  9. Sala-Rabanai M, Loo DDT, Hirayama BA, Turk E, Wright EMJ: Molecular interactions between dipeptides, drugs and the human intenstinal H+ oligopeptide cotransporter hPEPT 1. J Physiol 2006, 574:149–166.
  10. Gudasheva TA, Voronina TA, Ostrovskaya RU, Rozantsev GG, Vasilevich NI, Trofimov SS, Kravchenko EV, Skoldinov AP, Seredenin SB: Synthesis and antimnestetic activity of a series of N-acylprolyl-containing dipeptides. Eur J Med Chem 1996, 31:151–157.
  11. Seredenin SB, Voronina TA, Gudasheva TA, Ostrovskaya RU, Rozantsev GG, Skoldinov AP, Trofimov SS, Halikas J, Garibova TL: Biologically active N-acylprolyldipeptides having antiamnestic, antihypoxic effects. US patent 1995. No. 5.439.930.
  12. Ostrovskaya RU, Gudasheva TA, Trofimov SS, Kravchenko EV, Firova FV, Molodavkin GM, Voronina TA, Seredenin SB: GVS-111, an AcylprolylContaining Dipeptide With Nootropic Properties. In Biological Basis of Individual Sensitivity to Psychotropic Drugs. Edited by Seredenin SB, Longo V, Gaviraghi G. UK: Graffhan Press Ltd; 1994:79–91.
  13. Boiko SS, Ostrovskaya RU, Zherdev VP, Korotkov SA, Gudasheva TA, Voronina TA, Seredenin SB: Pharmacokinetics of new nootropic acylprolyldipeptide and its penetration across the blood–brain barrier after oral administration. Bull Exp Biol Med 2000, 129:359–361.
  14. Gudasheva TA, Bojko SS, Voronina TA, Akparov VK, Trofimov SS, Rozantsev GG, Skoldinov AP, Zherdev VP, Seredenin SB: The major metabolite of dipeptide piracetam analogue GVS-111 in rat brain and its similarity to endogenous neuropeptide cyclo-L-prolylglycine. Eur J Drug Metab Pharmacokinet 1997, 22:245–252.
  15. Ostrovskaya RU, Romanova GA, Barskov IV, Shanina EV, Gudasheva TA, Victorov IV, Voronina TA, Seredenin SB: Memory restoring and neuroprotective effects of the proline containing dipeptide, GVS-111, in a photochemical stroke model. Behav Pharmacol 1999, 10:549–553.
  16. Pealsman A, Hoyo-Vadillo C, Seredenin SB, Gudasheva TA, Ostrovskaya RU, Busciglio J: GVS-111 prevents oxidative damage and apoptosis in normal and Down’s syndrome human cortical neurons. Int J Dev Neurosci 2003, 21:117–124.
  17. Ostrovskaia RU, Gudasheva TA, Voronina TA, Seredenin SB: The original novel nootropic and neuroprotective agent Noopept. Eksp Klin Farmakol 2002, 65(5):66–72.
  18. Ostrovskaya RU, Gruden MA, Bobkova NA, Sewell RDE, Gudasheva TA, Samokhin AN, Seredenin SB, Noppe W, Sherstnev VV, Morozova-Roche LA: The nootropic and neuroprotective proline-containing dipeptide Noopept restores spatial memory and increases immunoreactivity to amyloid in an Alzheimer’s Disease model. J Psychopharmacol 2007, 21:611–619.
  19. Ostrovskaya RU, Belnik AP, Storozheva ZI: Noopept efficiency in experimental Alzheimer Disease (cognitive deficiency caused by beta-amyloid 25–35 injection into Meynert basal nuclei of rats). Bull Exp Biol Med 2008, 146:77–80.
  20. Ostrovskaya RU, Tsaplina AP, Vakhitova YV, Salimgareeva MK, Yamidanov RS: Effect of the novel cognition enhancing and neuroprotective dipeptide Noopept on the streptozotocin-induced model of sporadic Alzheimer Disease in rats. Eksp Klin Farmakol 2010, 73:2–6.
  21. Neznamov GG, Teleshova ES: Comparative studies of Noopept and piracetam in the treatment of patients with mild cognitive disorders in organic brain diseases of vascular and traumatic origin. Neurosci Behav Physiol 2009, 39(3):311–321.
  22. Gavrilova SI, Kolihalov IV, Fedorova JB, Kaljn JB, Selezneva ND: Expirience of Noopept clinical usage in the treatment of mild cognitive impairment syndrome. Modern Therapie of Psychiatric Disorders 2008, 1:27–32.
  23. Iversen LL, Mortishire-Smith RJ, Pollack SJ, Shearman MS: The toxicity in vitro of beta-amyloid protein. Biochem J 1995, 311(Pt 1):1–16.
  24. Jia X, Gharibyan AL, Öhman A, Liu Y, Olofsson A, Morozova-Roche LA: Neuroprotective and nootropic drug Noopept rescues α-synuclein amyloid cytotoxicity. J Mol Biol 2011, 414:699–712.
  25. Canevari L, Abramov AY, Duchen MR: Toxicity of amyloid beta peptide: tales of calcium, mitochondria, and oxidative stress. Neurochem Res 2004, 29(3):637–650.
  26. Henriques AG, Vieira SI, Da Cruz e Silva EF, Da Cruz e Silva OAB: Aβ promotes Alzheimer’s disease-like cytoskeleton abnormalities with consequences to APP processing in neurons. J Neurochem 2010, 113:761–771.
  27. Spires TL, Hyman BT: Neuronal structure is altered by amyloid plaques. Rev Neurosci 2004, 15(4):267–278.
  28. Postuma RB, He W, Nunan J, Beyreuther K, Masters CL, Barrow CJ, Small DH: Substrate-bound beta-amyloid peptides inhibit cell adhesion and neurite outgrowth in primary neuronal cultures. J Neurochem 2000, 74(3):1122–1130.
  29. Solntseva EI, Bukanova JV, Ostrovskaya RU, Gudasheva TA, Voronina TA, Skrebitsky VG: The effects of piracetam and its novel peptide analogue GVS-111 on neuronal voltage-gated calcium and potassium channels. Gen Pharmacol 1997, 29:85–89.
  30. Andreeva NA, Stel’mashuk EV, Isaev NK, Ostrovskaya RU, Gudasheva TA, Viktorov IV: Neuroprotective effects of nootropic dipeptide GVS-111 on the model of glucose-oxygen deprivation, glutamate toxicity and oxidative stress in vitro. Bull Exp Biol Med 2000, 130:418–421.
  31. Us KS, Klodt PM, Kudrin VS, Sapronova AY, Ostrovskaya RU, Ugryumov MV, Rayevsky KS: The effect of the synthetic neuroprotective dipeptide Noopept on glutamate slices. J Neurochem 2007, 1:138–142.
  32. Iqbal K, Liu F, Gong CX, Grundke-Iqbal I: Tau in Alzheimer disease and related tauopathies. Curr Alzheimer Res 2010, 7(8):656–664.
  33. Esmaeli-Azad B, McCarty JH, Feinstein SC: Sense and antisense transfection analysis of tau function: tau influences net microtubule assembly, neurite outgrowth and neuritic stability. J Cell Sci 1994, 107(Pt 4):869–879.
  34. Takei Y, Teng J, Harada A, Hirokawa N: Defects in axonal elongation and neuronal migration in mice with disrupted tau and map1b genes. J Cell Biol 2000, 150(5):989–1000.
  35. Wang JZ, Xia YY, Grundke-Iqbal I, Iqbal K: Abnormal hyperphosphorylation of tau: sites, regulation, and molecular mechanism of neurofibrillary degeneration. J Alzheimers Dis 2013, 33(Suppl 1):S123–S139.
  36. Alonso AC, Zaidi T, Grundke-Iqbal I, Iqbal K: Role of abnormally phosphorylated tau in the breakdown of microtubules in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A 1994, 91(12):5562–5566.
  37. Biernat J, Mandelkow EM: The development of cell processes induced by tau protein requires phosphorylation of serine 262 and 356 in the repeat domain and is inhibited by phosphorylation in the proline-rich domains. Mol Biol Cell 1999, 10(3):727–740.
  38. Busciglio J, Lorenzo A, Yeh J, Yankner BA: β-Amyloid fibrils induce tau phosphorylation and loss of microtubule binding. Neuron 1995, 14:879–888.
  39. Avila J, Pérez M, Lim F, Gómez-Ramos A, Hernández F, Lucas JJ: Tau in neurodegenerative diseases: tau phosphorylation and assembly. Neurotox Res 2004, 6(6):477–482.
  40. Gendron TF, Petrucelli L: The role of tau in neurodegeneration. Mol Neurodegener 2009, 4:13.
  41. Zheng WH, Bastianetto S, Mennicken F, Ma W, Kar S: Amyloid beta peptide induces tau phosphorylation and loss of cholinergic neurons in rat primary septal cultures. Neuroscience 2002, 115(1):201–211.
  42. Drechsel DN, Hyman AA, Cobb MH, Kirschner MW: Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau. Mol Biol Cell 1992, 3(10):1141–1154.
  43. Salinero O, Moreno-Flores MT, Ceballos ML, Wandosell F: beta-Amyloid peptide induced cytoskeletal reorganization in cultured astrocytes. Neurosci Res 1997, 47:216–223.
  44. Rapoport M, Dawson HN, Binder LI, Vitek MP, Ferreira A: Tau is essential to beta -amyloid-induced neurotoxicity. Proc Natl Acad Sci U S A 2002, 99(9):6364–6369.
  45. Jin M, Shepardson N, Yang T, Chen G, Walsh D, Selkoe DJ: Soluble amyloid beta-protein dimers isolated from Alzheimer cortex directly induce Tau hyperphosphorylation and neuritic degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A 2011, 108(14):5819–5824.
  46. Takashima A, Honda T, Yasutake K, Michel G, Murayama O, Murayama M, Ishiguro K, Yamaguchi H: Activation of tau protein kinase I/glycogen synthase kinase-3beta by amyloid beta peptide (25–35) enhances phosphorylation of tau in hippocampal neurons. Neurosci Res 1998, 31(4):317–323.
  47. Johansson S, Jämsä A, Vasänge M, Winblad B, Luthman J, Cowburn RF: Increased tau phosphorylation at the Ser396 epitope after amyloid beta-exposure in organotypic cultures. Neuroreport 2006, 17(9):907–911.
  48. Shimoke K, Sasaya H, Ikeuchi T: Analysis of the role of nerve growth factor in promoting cell survival during endoplasmic reticulum stress in PC12 cells. Methods Enzymol 2011, 490:53–70.
  49. Li L, Sengupta A, Haque N, Grundke-Igbal I, Igbal K: Memantine inhibits and reverses the Alzheimer type abnormal hyperphosphorylation of tau and associated neurodegeneration. FEBS Lett 2004, 566:261–269.
  50. Hu M, Schurdak ME, Puttfarcken PS, El Kouhen R, Gopalakrishnan M, Li J: High content screen microscopy analysis of A beta 1-42-induced neurite outgrowth reduction in rat primary cortical neurons: neuroprotective effects of alpha 7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor ligands. Brain Res 2007, 1151:227–235.
  51. Liu X, Xu K, Yan M, Wang Y, Zheng X: Protective effects of galantamine against Ab-induced PC12 cell apoptosis by preventing mitochondrial dysfunction and endoplasmic reticulum stress. Neurochem Int 2010, 57:588–599.
  52. Kurz C, Ungerer I, Lipka U, Kirr S, Schütt T, Eckert A, Leuner K, Müller WE: The metabolic enhancer piracetam ameliorates the impairment of mitochondrial function and neurite outgrowth induced by beta-amyloid peptide. Br J Pharmacol 2010, 160(2):246–257.

Informações sobre Publicação

Recebido: 9 de abril de 2014
Aceito: 28 de julho de 2014
Publicado: 6 de agosto de 2014

Citação

Ostrovskaya et al. Neuroprotective effect of novel cognitive enhancer noopept on AD-related cellular model involves the attenuation of apoptosis and tau hyperphosphorylation. Journal of Biomedical Science 2014; 21:74. DOI: 10.1186/s12929-014-0074-2